Desktop Tower Defense se joue sur une carte ressemblant à un bureau d'ordinateur. Le joueur doit empêcher un nombre défini d'ennemis, connus dans le genre sous le nom de « creeps », d'atteindre un point défini sur le terrain de jeu. Ceci est accompli en construisant et en améliorant des tours qui tirent sur les creeps ennemis, les endommagent et les tuent avant qu'ils ne puissent atteindre leur objectif. Contrairement à de nombreux autres jeux de tower defense, le chemin des creeps eux-mêmes n'est pas prédéfini ; au lieu de cela, les tours construites déterminent le chemin des creeps, qui empruntent le chemin le plus court qu'ils puissent trouver vers la sortie. Le jeu ne permet pas au joueur de rendre une sortie complètement inaccessible, mais les stratégies clés consistent à guider les creeps dans de longs corridors sinueux.